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            3-磷酸甘油醛脫氫酶活性檢測試劑盒

            簡要描述:

            3-磷酸甘油醛脫氫酶活性檢測試劑盒測定意義:
            GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途徑的關鍵酶,與糖異生途徑、體內血糖濃度的維持和糖尿病的發生密切相關,在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發揮重要作用。

            更新時間:2021-01-15型號:廠商性質:生產廠家瀏覽量:103

            3-磷酸甘油醛脫氫酶活性檢測試劑盒

            (微量法)

            正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定。

            產品貨號:BA1002

            產品規格:100管/96樣

            3-磷酸甘油醛脫氫酶活性試劑盒測定意義:

                  GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途徑的關鍵酶,與糖異生途徑、體內血糖濃 度的維持和糖尿病的發生密切相關,在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發揮重要作用。

            測定原理:

            3-磷酸甘油醛脫氫酶活性試劑盒活性檢測試劑盒催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和 NADH生成3磷酸甘油醛、無機磷和NAD,340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。

            需自備的儀器和用品:

            分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾 水。

            試劑的組成和配制:

                                         提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;

                                         試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;

                                         試劑二:液體20mL×1 瓶,4℃保存;

                                         試劑三:液體×1 支,4℃保存。

            樣本的前處理:

            1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(10 4 個):提取液體 積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功 率 20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

            2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液), 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

            測定步驟:

            1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

            2、樣本測定

            (1)工作液的配制:將試劑二全部倒入試劑一瓶中,充分溶解,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘; 現配現用。

            (2)在試劑三中加入500μL蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑4℃保存一周。

            (3)在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL 樣本、5μL試劑三和190μL工作液,混勻,加入后一個試劑的同 時開始計時,記錄340nm處20s時的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2,計算 ΔA=A1-A2。

            GAPDH 活性計算:

            a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

            (1)按樣本蛋白濃度計算: 單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

            GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(V樣×Cpr) ÷T

                                                              =1286×ΔA÷Cpr

            (2)按樣本鮮重計算 單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

            GAPDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

                                                          =1286×ΔA÷W 

            (3)按細菌或細胞密度計算 單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

            GAPDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                                                            =2.57×ΔA 

            V反總:反應體系總體積,2×10 -4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm; V樣:加入樣本體積,0.005 mL;

            V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度, mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬

            b.用96孔板測定的計算公式如下

            (1)按樣本蛋白濃度計算

            單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

            GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(V樣×Cpr) ÷T

                                                             =2572×ΔA÷Cpr

            (2)按樣本鮮重計算

            單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

            GAPDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

                                                          =2572×ΔA÷W

            (3)按細菌或細胞密度計算

            單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

            GAPDH(nmol/min/10 4cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                                                             =5.144×ΔA

            V反總:反應體系總體積,2×10 -4 L;ε:NADH 摩爾消光系數,6.22×10 3 L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm; V樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質濃度, mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。

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